Claudia Borsa1, Ioan Borsa2
1 Institutul National de Gerontologie si Geriatrie “Ana Aslan”, Bucuresti.
2 Spitalul Clinic de Urgenta pentru Copii “Grigore Alexandrescu”, Bucuresti.
Abstract
New research in stem cells field conducted to new technologies development for tissue engineering and regenerative medicine.
The discovery of induced pluripotent stem cells, iPSCs, opened new approaches in cellular therapy, disease modeling and tissue regeneration, including osteoregeneration.
The great potential of iPSCs for proliferation and differentiation in osteogenic lineage conducted to the development of new methods in bone regeneration.
Engineering of new viable bone substitutes from pacient-specific hiPSCs and/or MSC-hiPSCs on various osteoconductive scaffolds represents a promising therapeutic alternative for bone regeneration and repair.
Rezumat
Cercetari recente in domeniul celulelor stem au condus la dezvoltarea de noi tehnologii in ingineria tisulara si medicina regenerativa.
Descoperirea celulelor stem pluripotente induse, iPSCs a deschis noi cai in terapia celulara, nodekarea bolilor si regenerarea tisulara, inclusiv in osteoregenerare.
Potentialul mare al celulelor stem pluripotente induse, iPSCs de proliferare si diferentiere in linia osteogenica a condus la dezvoltarea de noi metode in regenerarea osoasa.
Obtinerea de noi substituenti ososi viabili din celule stem pluripotente induse umane specifice pacientului, hiPSCs, si/sau celule stem mezenchimale derivate din hiPSCs, MSCs-iPSCs pe diferite suporturi osteoconductive reprezinta o alternativa terapeutica promitatoare in regenerarea si repararea osoasa.
Introducere
Terapia celulara bazata pe celule stem reprezinta actual cea mai incitanta si promitatoare metoda pentru regenerarea si ingineria tisulara.
Obtinerea celulelor stem pluripotente induse (iPSCs, induced pluripotent stem cells) a deschis noi orizonturi in regenerarea osoasa, fiind considerata o sursa promitatoare de celule pentru medicina regenerativa.
Grefele osoase obtinute “in vitro” reprezinta o alternativa importanta in repararea defectelor osoase, iar celulele cu potential osteogenic, si in special celulele stem sunt baza ingineriei tisulare osoase.
Celulele stem mezenchimale umane (hMSCs, human mezenchymal stem cells), celule progenitoare multipotente, avand un mare potential de a se diferentia in osteoblasti, condrocite adipocite sau alte tipuri celulare, au fost utilizate cu succes in regenerarea osoasa (Jaiswal, 1997; Waese, 2008).
Celulele stem mezenchimale pot fi obtinute din diverse surse celulare, si anume: maduva osoasa, sange, grasime abdominala. In regenerarea osoasa rezultate foarte bune s-au obtinut cu MSCs derivate din maduva osoasa (BMSCs, bone marrow-derived MSCs), care au capacitatea de a promova formarea osoasa. Cantitatea de BMSCs autologe este limitata, dar numarul lor poate fi marit prin expandare in medii de cultura. De asemenea rata proliferarii BMSCs si potentialul lor osteogenic scade cu imbatranirea.
Obtinerea in 2006 a celulelor stem pluripotente induse, iPSCs, de Takahashi si Yamanaka din fibroblasti embrionici de soarece a deschis noi cai in medicina regenerativa. Un an mai tarziu doua grupuri de cercetatori, Yamanaka si colaboratorii(2007) si Thompson si colaboratorii (2007) au obtinut independent celule stem pluripotente induse umane (hiPSCs, human induced pluripotent stem cells) din fibroblasti umani adulti si celule somatice umane. Pentru aceasta importanta descoperire de reprogramare a celulelor mature in celule pluripotente, Shinya Yamanaka (Japonia) si John B. Gurdon (Regatul Unit al Marii Britanii) au primit in 2012 premiul Nobel in Fiziologie sau Medicina.
Surse celulare pentru generarea celulelor stem pluripotente induse, iPSCs
Celulele stem umane pluripotente induse, hiPSCs, pot fi generate pornind de la diferite surse celulare umane (Sun si col., 2010), si anume:
- fibroblasi
- keratinocite
- celule stem din sange
- celule stem de tesut adipos
- celule stem neuronale
- celule CD34 din sange periferic
- melanocite
- celule epiteliale renale
Cercetari recente au demonstrat ca pentru producerea de celule stem pluripotente induse de inalta calitate este nevoie de celule nediferentiate purificate provenite din tesuturi umane adulte. O sursa importanta, non-invaziva de obtinere a iPSCs umane o reprezinta celulele epiteliale renale exfoliate prezente in urina (Zhou si col., 2011). Sursa celulara generatoare de iPSCs influenteaza capacitatea lor de diferentiere, precum si pattern-ul lor epigenetic si transcriptional.
Obtinerea si diferentierea celulelor stem umane pluripotente induse, hiPSCs
Celulele hiPSCs pot fi obtinute din celule somatice prin introducerea unor factori transcriptionali de reprogragare, si anume: Oct3/4, Sox2, c-Myc, and Klf4 (OSMK)
(Takahashi si col., 2007; Thomson si col., 2007). Celulele hiPSCs astfel obtinute pot fi diferentiate in mezoderm, endoderm si ectoderm (Park si Im, 2014)
Diferentierea osteogenica a celulelor stem umane pluripotente induse, hiPSCs
Studii experimentale recente au demonstrat proprietatile osteogenice ale celulelor stem pluripotente induse, iPSCs. Astfel, in 2009, Tashira si colaboratorii au obtinut pentru prima data osteoblasti derivati din iPSCs de soarece.
Kao si colaboratorii au obtinut in 2010 osteocite pornind de la iPSCs de soarece cultivate in mediu osteogenic timp de 2 saptamani. Stimularea diferentierii osteogenice a acestor iPSCs s-a realizat cu resveratrol, un antioxidant polifenolic, obtinandu-se o acumulare marita de calciu si reglarea unor markeri osteogenici cum sunt: Runx2, osteopontin si sialoproteina osoasa.
Recent, Jin si colaberoatorii (2013) au studiat potentialul osteogenic al iPSCs umane pe suport polimeric de poli-caprolactona macrocanelata. Aceste grefe cu iPSCs umane , cultivate 14 zile in mediu osteogenic, au foast implantate subcutan la soareci. Rezultatele obtinute au relevat o mineralizare evidenta a grefelor dupa 4 saptamani. Diferentiere osteoblastica eficienta a iPSCs umane s-a obtinut si pe suport de nanofibre de polietersulfona (Ardeshirylajimi, 2013).
De asemenea, studii “in vitro” si “in vivo” au relevat stabilitatea fenotipului osteoblastic. Astfel, geluri spongioase impregnate cu osteoblasti derivati din iPSCs implantate la soareci au exprimat caracteristici osoase si chiar microvascularizare dupa 12 saptamani, precum si fenotip osteoblastic persistent (Bilousova si col., 2011).
Potentialul osteogenic al celulelor stem pluripotente induse umane, hiPSCs, pe suport de fibrina sau bioceramica (hidroxiapatita/ beta-tricalcium fosfat) a fost testat experimental in tratarea defectelor osoase de dimensiuni critice create in osul parietal al sobolanilor. Dupa 8 saptamani de la implant s-a observat vindecarea completa a defectelor osoase (Park si col., 2014).
Celule stem mezenchimale derivate din iPSCs
Celulele stem mezenchimale, MSCs (mesenchymal stem cells), celule progenitoare multipotente cu potential de diferentiere in osteoblasti, condrocite, adipocite si alte tippuri celulare; au fost utilizate cu succes in regenerarea osoasa. Sursa cea mai importanta de MSCs o reprezinta maduva osoasa; dar ele pot fi obtinute si din alte tesuturi sau sange. Intrucat potentialul lor de diferentiere osteogenica si rata proliferarii lor scade semnificativ cu varsta a fost necesara descoperirea de noi surse celulare. Asdtfel iPSCs au devenit o importanta tinta pentru diferentierea celulara si obtinerea de celule stem mezenchimale, MSCs.
Li si colaboratorii (2010) au obtinut MSCs pornind de la iPSCs murinice prin tratarea lor cu TGF-beta 1 (transforming growth factor beta-1) si acid retinoic. MSCs astfel obtinute au fost apoi diferentiate in osteoblastisi au creat os “in vivo”.
Recent, s-a reusit obtinerea MSCs din celule iPSCs umane, prin cultivarea lor pe colagen fibrilar de tip I (Liu si col., 2012).
Celulele MSCs derivate din iPSCs poseda un potential de diferentiere marit fata de celulele iPSCs nediferentiate.
De Peppo si colaboratorii (2013) au reusit obtinerea unui substituent de tesut osos functional, utilizand progenitori mezenchimali umani derivati din linii iPSCs provenite din diferite tesuturi. Cel mai mare potential de diferentierea fost exprimat de progenitorii mezenchimali proveniti din iPSCs derivate din celule stromale ale maduvei osoase. Dupa 12 saptamani de implantere, grefele continand MSCs derivate din iPSCs umane au ramas stabile.
Toate aceste rezultate demonstreaza fezabilitatea obtinerii de substituenti ososi pornind de la iPSCs specifice pacientului.
Pentru regenerarea osoasa si obtinerea de substituienti ososi viabili, specifici pacientului, celulele stem mezenchimale derivate din celule stem pluripotente induse specifice, MSCs-iPSCs, au fost incluse pe diverse suporturi, si anume: ciment de fosfat de calciu, hidroxiapatita cu nanofibre, polimeri, sau combinatiile lor.
Astfel, celulele MSCs-iPSCs umane pe suport de hidroxiapatita cu nanofibre de poli-caprolactona (Kang, 2014) au exprimat capacitati superioare de diferentiere pentru formarea matricei extracelulare calcificate. De asemenea, o buna viabilitate celulara s-a obtinut prin atasarea celulelor MSCs-iPSCs umane pe suport de ciment de fosfat de calciu (Tang, 2014), diferentierea buna in linia osteogenica si sintetizarea de minerale osoase. Acesti noi substituienti ososi cu celule specifice pacientului deschid noi orizonturi in regenerarea osoasa personalizata.
Concluzii
Datorita potentialului osteogenic, relevat in studii experimentale “in vitro’ si ‘in vivo”, celulele stem pluripotente induse, iPSCs, reprezinta o sursa celulara promitatoare in regenerarea osoasa.
Ingineria tisulara pe baza de celule iPSCs derivate din celule somatice autologe si obtinerea “in vitro’ de noi substituienti ososi cu celule specifice pacientului deschid noi orizonturi in regenerarea osoasa si medicina osteoregenerativa personalizata.
Bibliografie
Ardeshirylajimi, A., Hosseinkhani, S., Parivar, K., Yaghmaie, P., and Soleimani, M. Nanofiber-based polyethersulfone scaffold and efficient differentiation of human induced pluripotent stem cells into osteoblastic lineage. Mol Biol Rep 40, 4287, 2013.
Bilousova, G., Jun du, H., King, K.B., De Langhe, S., Chick, W.S., Torchia, E.C., Chow, K.S., Klemm, D.J., Roop, D.R., and Majka, S.M. Osteoblasts derived from induced pluripotent stem cells form calcified structures in scaffolds both in vitro and in vivo. Stem Cells 29, 206, 2011.
De Peppo, G.M., Marcos-Campos, I., Kahler, D.J., Alsalman, D., Shang, L., Vunjak-Novakovic, G., and Marolt, D. Engineering bone tissue substitutes from human induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A 110, 8680, 2013.
Jaiswal, N., Haynesworth, S.E., Caplan, A.I., and Bruder, S.P. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro. J Cell Biochem 64, 295, 1997.
Jin, G.Z., Kim, T.H., Kim, J.H., Won, J.E., Yoo, S.Y., Choi, S.J., Hyun, J.K., and Kim, H.W. Bone tissue engineering of induced pluripotent stem cells cultured with macrochanneled polymer scaffold. J Biomed Mater Res Part A 101, 1283, 2013.
Kao, C.L., Tai, L.K., Chiou, S.H., Chen, Y.J., Lee, K.H., Chou, S.J., Chang, Y.L., Chang, C.M., Chen, S.J., Ku, H.H., and Li, H.Y. Resveratrol promotes osteogenic differentiation and protects against dexamethasone damage in murine induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev 19, 247, 2010.
Li, F., Bronson, S., and Niyibizi, C. Derivation of murine induced pluripotent stem cells (iPS) and assessment of their differentiation toward osteogenic lineage. J Cell Biochem. 109, 643, 2010.
Liu, Y., Goldberg, A.J., Dennis, J.E., Gronowicz, G.A., and Kuhn, L.T. One-step derivation of mesenchymal stem cell (MSC)-like cells from human pluripotent stem cells on a fibrillar collagen coating. PLoS One 7, e33225, 2012.
Ran Kang, Yonglun Luo, Lijin Zou, Lin Xie, Helle Lysdahl Xiumei Jiang, Chunying Chen, Lars Bolund, Menglin Chen, Flemming Besenbacher and Cody Bünger. Osteogenesis of human induced pluripotent stem cells derived mesenchymal stem cells on hydroxyapatite contained nanofibers. RSC Adv., 2014, 4, 5734-5739
Siyeon Park, and Gun-Il Im. Embryonic Stem Cells and Induced Pluripotent Stem Cells for Skeletal Regeneration. Tissue Engineering, Part B, Volume 20, Number 5, 2014.
Siyeon Park, and Gun-Il Im. Embryonic Stem Cells and Induced Pluripotent Stem Cells for Skeletal Regeneration. Tissue Engineering, Part B, Volume 20, Number 5, 2014.
Sun, N., Longaker, M.T., and Wu, J.C. Human iPS cellbased therapy: considerations before clinical applications. Cell Cycle 9, 880, 2010.
Takahashi, K., and Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell, 126, 663, 2006.
Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., and Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131, 861, 2007.
Tang M, Chen W, Liu J, Weir MD, Cheng L, Xu HH. Human induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cell seeding on calcium phosphate scaffold for bone regeneration. Tissue Eng Part A. 2014 Apr; 20(7-8):1295-305.
Tashiro, K., Inamura, M., Kawabata, K., Sakurai, F., Yamanishi, K., Hayakawa, T., and Mizuguchi, H. Efficient adipocyte and osteoblast differentiation from mouse induced pluripotent stem cells by adenoviral transduction. Stem Cells 27, 1802, 2009
Waese, E.Y., Kandel, R.A., and Stanford, W.L. Application of stem cells in bone repair. Skeletal Radiol 37, 601, 2008.
Yu, J., Vodyanik, M.A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J.L., Tian, S., Nie, J., Jonsdottir, G.A., Ruotti, V., Stewart, R., Slukvin, I.I., and Thomson, J.A. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science, 318, 1917, 2007.
Zhou, T., Benda, C., Duzinger, S., Huang, Y., Li, X., Li, Y., Guo, X., Cao, G., Chen, S., Hao, L., Chan, Y.C., Ng, K.M., Ho, J.C., Wieser, M., Wu, J., Redl, H., Tse, H.F., Grillari, J., Grillari-Voglauer, R., Pei, D., and Esteban, M.A. Generation of induced pluripotent stem cells from urine. J Am Soc Nephrol 22, 1221, 2011.